Polymerase Chain Reaction (PCR)
واکنش زنجیره ای پلیمراز ،یک روش مولکولی است که قادر است هزاران کپی از یک ناحیه ی خاصی از  مولکول DNA یا RNA را بسازد.
بطور کلی، PCR بسیار کارآمد، سریع و دقیق است که میتواند توالی های DNA یا RNA را در نواحی مورد نظر ،ژن خاص یا سکانس خاص با پرایمر اختصاصی را تکثیر نماید. هنگامی که سکانس DNA مورد نظر بوسیله ی PCR تکثیر شد،  بااستفاده از الکتروفورز  تجزیه و تحلیل میشود.
این  نوع از PCR، PCR معمولی نامیده میشود. غیر از PCR معمولی، روش های جدیدی از PCR معرفی شده است که برای اهداف مختلف استفاده میگردد، که در اینجا به چند نوع از آنها که در آزمایشگاه تشخیصی کاربرد دارد، اشاره میگردد:
‏۱) ARMS - PCR
از روش ARMS - PCR برای تشخیص موتاسیون های نقطه ای در آزمایشگاه تشخیص مولکولی و ژنتیک استفاده میگردد.

‏۲) Real- Time PCR (RT -PCR)
اساس RT-PCR بر اساس PCR معمولی است، بااین تفاوت که مقدار کپی DNA در زمان واقعی را میتوان بررسی کرد. در واقع یک روش کمی است که مقدار کپی از ویروس، باکتری یا ژن هدف را مشخص مینماید که پزشک بر اساس تعداد کپی عامل پاتوژن مقدار دوز دارو را برای بیمار تجویز میکند.

Real -Time Multiplex PCR (۳
در این PCR چندین پرایمر برای تکثیر چندین عامل پاتوژن، ویروس یا ژن در یک ران کاری، برای تشخیص استفاده میگردد.
امروزه RT-PCR به دلیل حساسیت بالا و تکرار پذیری مناسب به صورت گسترده در تشخیص مولکولی و تحقیقاتی استفاده میگردد. اکثر PCR در قالب کیفی محسوب میشوند، ولی با RT-PCR میتوان لود ویروس ، عوامل پاتوژن ویا ژن خاص را بررسی کرد که کمی تلقی میگردد.
برای تشخیص موفقیت آمیز و قابل اعتماد RT-PCR ، به مقدار کافی اسید نوکلئیک DNA و RNA تجزیه نشده نیاز میباشد. همچنین به آنزیم Reverse  Transcriptase، dNTPs، Primer، TaqMan Prob و DNA Polymerase نیاز می باشد.
اولین مرحله RT-PCR، رورس ترانس کریپشن است.
در این مرحله RNA هدف به وسیله آنزیم رورس ترانسکریپتاز به DNA تبدیل میشود. سپس این DNA وارد فاز PCR میشود که شاملDenaturation،  Annealing وExtension میباشد.
پروب تکمن در RT-PCR استفاده میشود، که شامل یک Reporter در انتهای `5 و یک Quencher در انتهای `3 است.
آنزیم  DNAپلیمراز در فاز Extension پس از نزدیک شدن به پروب، آنرا تجزیه کرده و سپس از اثر Quencher، ماده Reporter جدا شده و از خود فلورسانس ساطع میکند که توسط دستگاه ثبت میشود که در نتیجه برای هر نمونه یک گراف بوسیله دستگاه ترسیم شده که میزان لود اسیدنوکلئیک را در هر نمونه نشان میدهد.



در حال حاضر در آزمایشگاه دکتر قلی زاده-دکتر اسفندی RT-PCR و Real-Time Multiplex PCR انجام میشود که از دستگاه  corbett Real - time PCR Thermocycler Qaigen استفاده میگردد.
نمونه های DNA و RNA ، بوسیله دستگاه تمام اتوماتیک QIA cube (از کمپانی کیاژن)جدا گردیده و برای RT-PCR آماده میگردد، که این دستگاه در ورامین فقط در آزمایشگاه دکتر قلی زاده-دکتر اسفندی جهت جلوگیری از آلودگی نمونه ها و افزایش دقت جواب ها خریدار شده است. QIA cube یک پلتفرم بسته است که قادر است پردازش دوازده نمونه را در هر ران کاری به طور خودکار انجام دهد. از طریق صفحه لمسی LCD جلوی دستگاه، پروتکل استخراج نمونه ها به دستگاه داده میشود.


فهرست آزمایش های بخش مولکولی آزمایشگاه دکتر قلی زاده-دکتر اسفندی:۱) ارزیابی لود ویروس در عفونت‌های HIV ،HCV و HBV
بوسیله Real -Time PCR

‏ ۲) تعیین HLA - B27 بوسیله Real -Time PCR

۳) تعیین ژنوتایپهای بیماری زای ویروس پاپیلوما انسانی (HPV) بوسیله Real -Time Multiplex PCR

لازم است به اطلاع رسانده شود علاوه بر تشخیص لود ویروس HIV، HCV و HBV، با Real -Time PCR می توان طیف وسیعی از بیماریهای عفونی مثل سل، آنفولانزا و کووید -۱۹  و غیره را تشخیص داد. همچنین Real-Time PCR در تشخیص mRNA  در انواع سرطان ها از جمله لوکمیا کار برد دارد. برای تشخیص علت ژنتیکی در سرطان ها مثل AML، ALL CML نیز می توان از Real-Time PCR استفاده کرد.


لازم به ذکر است آزمایشگاه دکتر قلی زاده-دکتر اسفندی با کادری مجرب و کاربلد (کارشناس آزمایشگاه و کارشناس ارشد ژنتیک) آزمایشات بخش مولکولی را منطبق بر استاندارد روز در حوزه ی تشخیص انجام داده و در خدمت همشهریان عزیزمان میباشد.


گردآوری و ترجمه: بخش تحقیق و توسعه آزمایشگاه  دکتر قلی زاده-دکتر اسفندی، ورامین.منابع:

Pfaffl, Michael W. "Quantification strategies in real-time PCR." AZ of quantitative PCR 1 (2004): 89-113.


Mackay, Ian M., Katherine E. Arden, and Andreas Nitsche. "Real-time PCR in virology." Nucleic acids research 30.6 (2002): 1292-1305.

https://www.sigmaaldrich.com/life-science/molecular-biology/pcr/routine-amplification.html?gclid=Cj0KCQjw0rr4BRCtARIsAB0_48PQD8K7tg3jXzNUDhViZio3rvTxVUUdzAxlaig9AAYXlrKPhaxfFfEaAmduEALw_wcB